cKO小鼠模型構(gòu)建方法及應(yīng)用

1. 構(gòu)建方法

cKO（條件性基因敲除）小鼠模型是一種在特定組織或特定發(fā)育階段實(shí)現(xiàn)基因敲除的技術(shù)，通過使用Cre-LoxP系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。以下是構(gòu)建cKO小鼠模型的主要步驟：

設(shè)計(jì)LoxP位點(diǎn)：在目標(biāo)基因的特定位置插入LoxP位點(diǎn)，通常是插入到目標(biāo)基因的外顯子兩側(cè)。這些LoxP位點(diǎn)是Cre重組酶的識(shí)別位點(diǎn)。

構(gòu)建Flox小鼠：通過同源重組技術(shù)，將含有LoxP位點(diǎn)的基因構(gòu)建導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）中，然后將這些細(xì)胞注射到囊胚中，形成嵌合體小鼠。通過交配，獲得攜帶LoxP位點(diǎn)的Flox小鼠。

引入Cre重組酶：將Flox小鼠與組織特異性Cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配，使Cre重組酶在特定組織或發(fā)育階段表達(dá)。Cre重組酶會(huì)識(shí)別LoxP位點(diǎn)并切除目標(biāo)基因，從而實(shí)現(xiàn)條件性敲除。

2. 基因型鑒定

PCR鑒定：通過設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)小鼠基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測LoxP位點(diǎn)和Cre基因的存在。

Southern blotting：通過限制性酶切和探針雜交，檢測LoxP位點(diǎn)的整合情況和目標(biāo)基因的敲除情況。

3. 應(yīng)用

cKO小鼠模型在研究基因功能和疾病機(jī)制方面具有重要應(yīng)用。以下是一些具體的應(yīng)用實(shí)例：

研究ETV1在心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)中的作用：通過將Etv1-flox小鼠與表達(dá)Cre重組酶的Mph-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配，實(shí)現(xiàn)了ETV1在心肌細(xì)胞中的特異性敲除。研究發(fā)現(xiàn)，ETV1的特異性敲除導(dǎo)致心臟傳導(dǎo)缺陷，特別是影響了快速傳導(dǎo)基因網(wǎng)絡(luò)的表達(dá)。

研究p53在腫瘤發(fā)生中的作用：通過構(gòu)建p53條件性基因敲除小鼠模型（p53-CKO），與組織特異性Cre工具鼠交配，獲得特定組織或細(xì)胞中p53純合缺失的小鼠，用于腫瘤發(fā)生和機(jī)制研究。

研究ASH1L在大腦發(fā)育中的作用：通過在ASH1L基因的第4外顯子兩側(cè)插入LoxP元件，利用Cre重組酶導(dǎo)介的基因敲除技術(shù)，構(gòu)建了ASH1L條件性敲除（cKO）小鼠模型。研究發(fā)現(xiàn)，ASH1L的缺失導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)多種行為異常和生理缺陷，特別是在大腦發(fā)育過程中。

4. 優(yōu)勢與局限性

優(yōu)勢：cKO小鼠模型可以在特定組織或發(fā)育階段實(shí)現(xiàn)基因敲除，避免了全身性敲除可能引起的胚胎致死性問題，能夠更精確地研究基因在特定生理過程中的作用。

局限性：構(gòu)建cKO小鼠模型需要多個(gè)步驟，包括構(gòu)建Flox小鼠和Cre轉(zhuǎn)基因小鼠，過程較為復(fù)雜且耗時(shí)。